問題

可能原因

解決辦法

轉膜不充分導致信號較弱

膜沒有完全均勻濕透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10000

選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間

靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液PH值

嘗試使用其他緩沖液

甲醇濃度過高

降低甲醇濃度或者使用乙醇/異丙醇替代

轉移時間不夠

對于厚的膠以及高分子量蛋白質需要延長轉移時間

洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數

阻斷不充分

增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。

二抗濃度過高

降低二抗濃度

檢測過程中膜干燥

保證充分的反應液

曝光過度

縮短曝光時間

抗體與阻斷蛋白有交叉反應

檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應

沒有陽性條帶或條帶信號較弱

抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間

酶活降低甚至失活

直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內，有活性的酶聯物

標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因

試劑不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性

一抗失效

選擇在有效期內抗體，并選擇現配現用的工作液

洗膜過度

縮短洗滌時間

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

抗體活性降低

選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置

蛋白轉移不充分

見上述

封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型

曝光時間過短

延長曝光時間

條帶位置（大小）不對，或有非特異性條帶

二抗的非特異性結合

增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的）

一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性

蛋白降解

使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑，實驗中增加內參

蛋白二聚體或多聚體存在

增加蛋白質變性過程及強度

抗體濃度過高

降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶

蛋白上樣量過大

降低樣本上樣量

背景斑駁

封閉劑中有聚集體

使用前過濾封閉劑

HRP耦聯二抗中有聚集體

過濾二抗試劑，去除聚集體

膜上出現反像

HRP含量過高

降低酶聯二抗的濃度