? ? ?中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，已成為治療用蛋白類生物制品生產的主要細胞類型。隨著瞬時轉染技術(transient transfection)的進步，搭配CHO細胞進行毫克至克級別蛋白的快速、高效生產，幫助推動藥物研發階段進程，允許更早的評估候選藥物是否具備理想屬性，從而投入更多資源生成穩定的克隆細胞系，用于后續藥物的臨床開發。
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? ? ? ?憑借20年在核酸遞轉領域的深耕細作，Mirus推出了用于CHO細胞蛋白/抗體生產的完整瞬轉系統——CHOgro? High Yield Expression System。通過整合Mirus獨有的專利轉染技術及優化的CHO培養基，相比于現有技術方案，可將蛋白表達量提升2-10倍。除此之外，該系統不含動物源性成分，致力于穩定的提高懸浮CHO細胞的蛋白質產量。本文首先就影響CHO細胞在蛋白表達實驗中的關鍵影響因素進行討論，包括轉染試劑、培養基選擇、增強子使用及培養溫度優化；Mirus CHOgro? High Yield Expression System體系，綜合考慮上述影響CHO蛋白表達的關鍵因素，并且將轉染試劑、培養基及增強子進行優化、整合；最后，結合Mirus CHOgro? High Yield Expression System針對不同蛋白/抗體類型的表達產量、體系放大以及細胞類型適配性數據，充分證明了Mirus CHOgro? High Yield Expression System具備高產量、高穩定性、廣泛的適配性以及操作靈活性等優勢。

Mirus CHOgro? High Yield Expression System（產品貨號：MIR 6270）中包括了以下組分：

CHO細胞蛋白表達關鍵影響因素之轉染試劑

CHOgro? High Yield Expression System系統中關鍵組分TransIT-PRO?轉染試劑，通過優化瞬時轉染效率，可進一步提高目標蛋白/抗體產量。同樣的，該轉染試劑不含動物源成分，可以與懸浮CHO或者293細胞搭配使用，并且可以兼容不同種類的培養基，旨在提高生產蛋白/抗體產量及穩定性。

測試使用CHOgro? High Yield Expression System系統中TransIT-PRO?轉染試劑（試劑:DNA比例為1:1），在CHO-S細胞瞬轉表達GFP熒光蛋白。轉染后48小時，分別使用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測試劑轉染效率和細胞活力。結果表明，單獨使用TransIT-PRO?轉染試劑，可達到高水平的轉染效率（圖1）。

圖1. 單獨使用Mirus CHOgro? High Yield Expression系統中的轉染試劑（TransIT-PRO? 轉染試劑），也有著高水平的轉染效率。

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CHO細胞蛋白表達實驗關鍵影響因素之培養基

CHOgro? High Yield Expression System中的另一關鍵組分CHOgro? Expression Medium，也是提升CHO細胞蛋白/抗體表達量的重要因素。細胞的生長狀態、是否結團、細胞密度等都是評估CHO細胞培養基的關鍵參數。

在細胞生長狀態方面，轉染FreeStyle? CHO-S細胞后，分別在CHOgro? Expression Medium和其他品牌培養基中進行培養。轉染后六天，用CHOgro? High Yield Expression System中的CHOgro? Expression Medium培養的細胞結團數量明顯少于其他品牌培養基（圖2）。

圖2. 使用Mirus CHOgro? High Yield Expression System中的CHOgro? Expression Medium進行培養（左），細胞結塊數量顯著少于其他培養基培養的CHO-S細胞（右）。

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同樣的，使用相同細胞系（FreeStyle? CHO-S）及細胞密度（0.5×106 cells/ml），平行比較Mirus CHOgro? Expression培養基及其他品牌培養基。實驗結果顯示，在Mirus CHOgro? Expression培養基中生長的細胞，有著更高的細胞密度，這也是提高CHO細胞蛋白/抗體產量的重要前提。并且，在更高的細胞密度條件下，仍保持較高的細胞活性（圖3）。

圖3. 使用CHOgro? Expression Medium培養，CHO細胞密度更高，并且保持著較高細胞活性。

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CHO細胞蛋白表達實驗關鍵影響因素之增強子

使Mirus研發團隊針對不同應用或者細胞類型，開發出多種相適配增強子，例如針對CHO細胞蛋白/抗體生產的增強子CHOgro? Titer Enhancer，也是包含在CHOgro? High Yield Expression System中的一個關鍵組分。其作用機制并非直接增加細胞的轉染效率，而是通過調節細胞內特定的信號通路來增加CHO細胞的蛋白表達滴度。平行實驗分別對比了CHO細胞對Fc融合蛋白與IgG的表達量，結果表明，與單獨使用TransIT-PRO? 轉染試劑相比，加入CHOgro? Titer Enhancer后，CHO細胞Fc融合蛋白的產量有顯著提升（圖4）。此外，與PEI轉染體系相比，使用CHOgro系統的轉染試劑和增強子，CHO細胞IgG的表達量可提高約3倍（圖5）。

圖4. 加入CHOgro? Titer Enhancer后，CHO細胞Fc融合蛋白的產量有顯著提升

圖5. TransIT -PRO?轉染試劑搭配CHOgro? Titer Enhancer，相較于PEI轉染體系，CHO細胞IgG的表達量可提高約3倍

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CHO細胞蛋白表達實驗關鍵影響因素之培養溫度

Mirus CHOgro? High Yield Expression System除了通過培養基、轉染試劑以及增強子三者的優化結合，在實驗流程上也可以進行優化，從而進一步提高蛋白產量。根據科研或者不同應用需求，Mirus CHOgro? High Yield Expression System有著多種靈活實驗方案供選擇：

方案一：Mirus CHOgro? High Yield Expression System實驗方案中所推薦的標準流程，即在轉染當天加入CHOgro? Titer Enhancer，并立刻將細胞培養溫度從37℃轉移至32℃，轉染后7-8天內收獲蛋白，細胞活性仍可保持70%以上；

方案二：在方案一的基礎上通過添加補料來延長細胞培養時間，保證細胞更長時間維持較高的密度和活率，將蛋白收獲時間延長至7-11天；

方案三：轉染后的細胞仍維持在37℃條件下培養，不加入補料，并在最短時間（4-5天）收獲蛋白；

方案四：轉染后的細胞仍維持在37℃條件下培養，通過在轉染后18-24小時添加補料維持細胞密度和活率，將蛋白收獲時間延長至4-7天。（有關添加細胞培養補料以維持細胞活率的建議，請參閱完整版實驗方案）（圖6）。

圖6. CHOgro? High Yield Expression System的多種細胞培養方案

基于以上四種實驗方案，分別測試了在轉染后32℃和37℃培養條件下，以及是否添加補料對CHO細胞IgG產量的影響。實驗使用CHOgro? High Yield Expression System，加入轉染復合物及CHOgro? Titer Enhancer后，立即將CHO細胞轉移至32℃（左）或保持在37℃（右）。結果顯示，轉染后將細胞轉移到32℃條件下培養，IgG產量更高且細胞存活時間更長（圖7）。

圖7. 轉染后將細胞轉移到32℃條件下培養，IgG產量更高且細胞存活時間更長

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盡管Mirus CHOgro? High Yield Expression System從CHO細胞蛋白表達實驗關鍵組分即轉染試劑、培養基和增強子進行了優化整合，并提供了靈活的實驗應用方案來提升CHO細胞的蛋白產量，那么在實際生產過程中，該系統針對不同類型蛋白/抗體的產量、體系放大以及細胞類型適配性如何呢？

Mirus CHOgro? High Yield Expression System針對不同類型蛋白/抗體的表達，有著更高產量

使用相同的細胞類型（FreeStyle? CHO-S cells）和質粒骨架，分別表達六種不同的治療性抗體，比較測試了Mirus CHOgro? High Yield Expression System和其他品牌表達系統。實驗結果表明，在所有測試的六種抗體類型中，使用Mirus CHOgro? High Yield Expression System的CHO細胞表達的蛋白滴度更高，并且轉染試劑用量更少，蛋白生產成本更低（圖8）。

圖8. 相比其他品牌CHO轉染表達系統，Mirus CHOgro? High Yield Expression System有著更高的蛋白產量

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CHOgro? High Yield Expression System生產規模的可擴展性

通過對6孔板（細胞培養體積2mL）至5L搖瓶（細胞培養體積2L）等不同培養體積進行轉染，對CHOgro? High Yield Expression System生產規模的可擴展性進行評估，實驗結果表明，從最小反應體系（6孔板）至最大反應體系（5L搖瓶），生產體系放大了1000倍，都有著近似的蛋白滴度，意味著CHOgro? High Yield Expression System可以整合到不同CHO細胞蛋白/抗體研究和生產工作流中（圖9）。

圖9. Mirus CHOgro? High Yield Expression System的生產體系擴大1000倍，依然保持著近似的蛋白產量。

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CHOgro? High Yield Expression System不同CHO細胞適配性

選擇兩種常用于蛋白/抗體生產的CHO懸浮細胞CHO-S和ExpiCHOTM，評估CHOgro? High Yield Expression System對不同CHO細胞類型的適配性。實驗結果表明，CHOgro? High Yield Expression System可適配多種CHO細胞類型，在不同CHO細胞中的蛋白表達也有著近似的產量（圖10）。

圖10. Mirus CHOgro? High Yield Expression System可適配不同CHO細胞類型

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綜合上述，通過上述Mirus CHOgro? High Yield Expression System的測評數據，表明了該系統具有以下特點及優勢：

• 更高的蛋白產量：可將CHO細胞瞬轉的蛋白表達量提升2-10倍
• 可穩定放大生產體系：將轉染體系放大1000倍，其蛋白表達量依然保持穩定
• 適配不同類型CHO細胞：搭配不同類型CHO細胞也可得到近似蛋白產量

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如何查找或選擇適合的轉染試劑？

? ? 請登錄Mirus官網線上工具Reagent Agent?，支持超過1000種細胞類型、多種核酸類型轉染試劑查詢。

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Mirus產品年鑒

? ? ? ?美國Mirus公司成立于1995年，是世界上很早開發高效、低毒轉染試劑的公司，同時也是該類試劑的主要供應商之一。其產品線涵蓋化學轉染試劑、電轉染產品、病毒生產和轉導產品，適用于基因功能研究、蛋白生產、病毒載體生產和動物模型構建等領域。Mirus被公認為轉染試劑開發的領跑者，其許多杰出成果獲得世界公認與廣大用戶的好評。

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? ? 北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區代理，始終秉承著專業、嚴謹的態度為客戶提供優質的產品與服務，Mirus熱銷轉染產品常備現貨。如果您對上述產品感興趣，歡迎致電北京西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網站www.gp82.cn了解更多產品信息。

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