在生物制藥領域，對宿主細胞蛋白(HCPs)的精準分析與控制是確保藥物安全與有效性的關鍵環節。各國法規都有關于HCPs的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCPs降低到可接受的水平。

不同監管機構宿主細胞蛋白(HCPs)法規要求:

• 《中國藥典》(2020版)三部規定：針對CHO細胞，HCPs殘留需要<0.05%(相當于小于500ppm)；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。
• 美國藥典USP<1132>章節規定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCPs，其含量應該低于檢測限(通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCPs含量應小于100ng，也即<0.01%)。
• 歐洲藥典EP 2.6.34中規定：在生物制品中，HCP的含量應當小于0.1%。
• 國際人用藥品注冊技術協調會(ICH)指南：ICH Q6B指出，需要根據ICH準則采用敏感且經過驗證的有效方法來監控殘留的HCPs，其殘留量通常要求小于100ppm。
• ELISA是各國藥典推薦的在生物制品中檢測殘留HCPs的方法，可以測定HCPs的總量。并且ELISA的操作簡便，是經典的免疫學檢測方法。但ELISA檢測HCPs也有方法的局限性，比如不能從ELISA的結果中知道樣品中有哪些HCPs，或者用于檢測的抗體與哪些HCPs發生了免疫反應。因此，監管部門要求在使用ELISA檢測過程中HCPs殘留含量時，不僅要通過方法學驗證證明試劑盒的準確度，精密度，靈敏度等，而且還需要證明使用的HCPs抗體有廣泛的反應性，即HCPs抗體覆蓋率。
  

圖 1 HCP ELISA試劑盒檢測流程

什么時候做HCPs抗體覆蓋率驗證？

美國藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS將HCPs檢測方法分為：商業化試劑盒、產品/工藝專屬性方法和平臺化方法。并指出在產品開發的不同階段，推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCPs的檢測。

USP<1132>提到在沒有平臺化方法的情況下可以在臨床前、臨床I期、II期使用商品化試劑盒；在臨床III期/工藝驗證及產品上市后，由于商業化的通用HCP檢測試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性，需要考慮結合細胞類型及工藝特異性等因素，使用平臺化方法或針對上游工藝開發的產品/工藝專屬性方法。

而在臨床II期后若是需要繼續使用商品化試劑盒，就需進行HCPs抗體覆蓋率驗證來評估試劑盒是否可以繼續用于質量監控。通常推薦在臨床II期末或者臨床三期前的這個階段去做覆蓋率驗證，此時生產工藝已經固定并且有相對充足的時間。

圖2 USP <1132>產品開發的不同階段HCP檢測方法的建議

HCP覆蓋率驗證的不同技術路線

傳統的分析方法采用2D Western blot進行覆蓋率驗證，是基于等電點和分子量不同的原理，蛋白在凝膠上通過SDS-PAGE方法被分離。其中一張膠被銀染，另一張被轉到PVDF膜上，并結合ELISA試劑盒中的抗體進行Western Blotting檢測。但因其固有的方法學限制和技術挑戰，往往難以全面、準確地評估多克隆抗體對HCPs的覆蓋范圍。

2D WB方法限制因素：

• 負載能力低
• 樣品經過前處理會破壞蛋白天然表位
• HCPs結合到PVDF膜上導致損失部分檢測到的抗體信息
• 難以完全將PAGE凝膠與WB圖片對齊
• 特異性差，顯著低估真實抗體覆蓋率

為了克服這一難題，Cygnus Technologies于2014年創新性地推出了抗體親和提取(Antibody Affinity Extraction，AAE?)技術，目的是提高細胞培養收獲液中總HCPs混合物的靈敏度和覆蓋率評估，并可以檢測對下游工藝特異性HCPs的反應性，這些通常也是最為關注的HCPs。與2D-PAGE和2D-WB的靈敏度受負載能力等限制不同，AAE?的靈敏度可高出100倍以上，因為它能夠提取和濃縮大量樣品。

表 1 AAE與2D-WB覆蓋率技術路線對比

AAE分析流程首先將多克隆抗體共價固定在色譜柱上。然后對色譜柱進行條件調節，以防止抗體的顯著浸出并極大地減少任何非特異性結合。原始未變性的HCPs樣品通過色譜柱與抗體進行結合，隨后用酸洗脫。通過結合和洗脫，HCPs樣品再次在柱上循環，直到沒有其他HCPs被結合。所有收集的HCPs洗脫液再匯集、交換緩沖液并濃縮回原始樣品體積，為后續的分析提供高質量的樣本。在收集到HCPs樣本后，可以選擇通過2D-PAGE+銀染或MS質譜進行后續分析。

圖3 USP <1132>產品開發的不同階段HCP檢測方法的建議

抗體對下游HCPs的反應性和AAE-MS?的HCPs鑒定

   AAE?技術的優勢不僅在于其高靈敏度，更在于其強大的預測能力和廣泛的應用前景。通過AAE-MS?獲得的覆蓋率的結果更高、更真實，可以更準確地預測抗HCPs抗體在ELISA中的表現。并且，AAE?與質譜聯用(AAE-MS?)能夠識別收獲材料中與抗體反應的HCPs，并獲得蛋白質的分子量和等電點(pI)信息，可以評估純化過程中持續存在的單個HCPs，并優化下游純化工藝。

圖4 F650S HEK2 93抗體覆蓋率驗證

值得一提的是，AAE?技術在檢測并證明對單個下游HCP的反應性方面表現出色。更主要的是質譜可以對樣品中是否存在潛在高風險的HCPs做出鑒定并提供這些蛋白的注釋信息。通過AAE?技術，能夠更準確地識別和量化這些高風險HCPs。這些通過特定純化過程持續存在的高風險HCPs對于患者安全、藥物功效和穩定性至關重要，無論是藥物研發人員還是監管人員都能通過這一技術清楚地了解工藝中某個HCP的殘留情況，從而為藥物的研發和生產提供強有力的支持。

表 2 CHO細胞高風險HCPs

AAE-MS?在藥物原液和過程樣品監控中的應用

AAE-MS?也可以對藥物原液中HCPs富集的同時去除了大部分原料藥。去除原料藥極大地提高了通過2D-PAGE和質譜分析識別單個HCPs的能力，因為藥品通常以104-106的倍數掩蓋HCPs。AAE-MS?是一種更客觀和直接的方法檢測和鑒定原料藥中任何潛在的HCPs雜質以幫助優化下游純化工藝。

圖5 AAE對藥物原液中HCPs的富集

圖6  AAE-MS?對藥物原液中高風險HCPs的富集和鑒定

總之，抗體親和提取(AAE?)技術以其卓越的性能和廣泛的應用前景，正在逐步成為生物制藥領域HCPs分析的新標準。它不僅能夠克服傳統方法的局限性，更在靈敏度、預測能力和應用深度上實現了顯著提升。隨著技術的不斷發展和完善，相信AAE?將在未來為更多藥物的研發和生產貢獻力量，為患者帶來更加安全、有效的治療方案助力。

支持文獻

[1] USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.

[2] USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.

[3] EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.

[4] Host Cell Protein Analysis: Immunoassays and Orthogonal Characterization By Antibody Affinity Extraction and Mass Spectrometry Methods

[5] Antibody Affinity Extraction (AAE?) - A superior alternative to 2D Western blot for determination of polyclonal anti-HCP reactivity.

[6] Antibody Affinity Extraction (AAE?) Empowers HCP Identification by Mass Spectrometry.